Cleber Barros¹
Desde a apresentação da estrutura da molécula
de DNA e de sua replicação semiconservativa proposta por Watson e Crick na
década de 1950, houve um grande progresso nos estudos de biologia molecular. O
reconhecimento da complementaridade entre os nucleotídeos da dupla hélice e de
seu mecanismo de replicação aliados aos conhecimentos sobre a reprodução de
bactérias deu início ao que se chamou de tecnologia do DNA recombinante. Com
esta tecnologia surgiu Hibridização in situ (HIS).
A técnica denominada de hibridação in situ
consiste basicamente no pareamento de determinado segmento de DNA ou RNA com
uma sequência de nucleotídeos complementar situada dentro da célula, visando
verificar se esta possui essa sequência e qual a sua exata localização. Devido
ao seu grande desenvolvimento, esta técnica se tornou uma das mais informativas
em citologia, sendo atualmente usada na biologia do desenvolvimento,
citotaxonomia, citogenética clínica e melhoramento genético. Entretanto, para
alcançar os objetivos com resultados satisfatórios, é necessário que as lâminas
utilizadas sejam de boa qualidade, um bom número de metáfases com cromossomos
bem espalhados. Quanto maior o nível estringência maior será a confiabilidade
de sua hibridação, sendo, no entanto, necessária uma grande quantidade de
DNA-alvo para que ocorra o processo na maioria das células.
As sondas
utilizadas na hibridização podem ser de variados tipos, de acordo com o tipo da
seqüência do DNA usada e, ou, da forma como está disposta na molécula. Das
técnicas de hibridização utilizadas, a que mostra maior facilidade na obtenção
das sondas é a genômica in situ (GISH), pelo fato das sondas serem formadas
pela fragmentação do DNA total. O tamanho das sondas é um requisito importante
a ser considerado para o sucesso do processo de hibridização, pois seqüências
muito pequenas podem hibridizar regiões do DNA que não são o alvo do estudo.
Por outro lado, seqüências muito grandes apresentam grande dificuldade em
penetrar a célula e alcançar o alvo ou por possuírem freqüentemente DNA
repetitivo disperso também podem ocasionar o pareamento fora da região alvo.
Atualmente
são empregadas algumas variantes da FISH, como por exemplo, a técnica de PRINS
(PRimed IN Situ labeling), onde a sonda é hibridizada in situ antes de ser marcada,
pois nesta técnica a sonda funciona como um iniciador para a síntese de uma Taq
polimerase que expande sua extremidade 3’ com nucleotídeos marcados,
evidenciando as regiões do DNA-alvo em estudo. A partir da técnica de PRINS foi
desenvolvida a técnica denominada C-PRINS (Cycling-PRINS), que amplifica o
DNA-alvo in situ, com a utilização de dois iniciadores flanqueando o DNA-alvo
como numa reação de PCR, incluindo todos os iniciadores, os nucleotídeos
marcados e não-marcados e uma Taq polimerase, sendo o processo desenvolvido em
lâminas introduzidas em termociclador que aceita lâminas em vez de Eppendorfs.
O resultado do processo é a marcação do sítio do DNA-alvo com maior rapidez,
maior sensibilidade e poder de resolução.
Referência
Trabalho cedido pelo Prof.
Titular da Universidade do Estado de Mato Grosso. Waldo Troy, arquivo próprio.
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